診斷試劑中化學(xué)發(fā)光底物吖啶酯的標(biāo)記原理化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)中,我們用吖啶酯先標(biāo)記上抗體蛋白,才能在免疫反應(yīng)后對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè),因此如何標(biāo)記抗體就非常的關(guān)鍵了。吖啶鹽和相關(guān)化合物已被廣泛證明為非常有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物,其穩(wěn)定性、標(biāo)記特異性和檢測(cè)靈敏度都超越放射性同位素。
吖啶酯-NHS即吖啶琥珀酰亞胺酯(本試劑盒所提供)能與蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基發(fā)生反應(yīng)。在堿性條件下,NHS作為離去基團(tuán)被取代,蛋白質(zhì)與吖啶酯形成穩(wěn)定的酰胺鍵。反應(yīng)完成后,多余的吖啶鹽通過(guò)脫鹽柱除去。在堿性過(guò)氧化氫存在下,吖啶標(biāo)記的蛋白不需要酶催化就可自行發(fā)光。
因此激發(fā)液的加入導(dǎo)致反應(yīng)體系立即釋放約430nm的光子,通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)光度計(jì)luminometer計(jì)數(shù)光子數(shù)量就可檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。因?yàn)榇税l(fā)光過(guò)程是十分短暫(整個(gè)過(guò)程在2秒鐘內(nèi)完成),樣品必須直接放在光度計(jì)內(nèi)部光子探測(cè)器前面。蛋白質(zhì)、多肽、抗體、核酸都可以用吖啶酯標(biāo)記。
化學(xué)發(fā)光試劑這里需要注意的是,溶解吖啶琥珀酰亞胺酯時(shí),使用的DMF必須嚴(yán)格無(wú)水,防止吖啶酯水解不使用時(shí),干燥密封-20°℃保存。針對(duì)傳統(tǒng)吖啶酯,在其結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了修飾,增大了位阻,增強(qiáng)了抗水解性。
如在室溫下,在pH為7.0的PB緩沖液中很穩(wěn)定。如果是不含-NHS的吖啶羧酸需要加入縮合劑EDCI等,才能與含胺基的蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。吖啶酰肼,含有游離氨基,吖啶酰肼末端適用直接偶聯(lián)含有醛基的多糖核酸或者蛋白質(zhì)等。
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